BJcuL, lectina do veneno de Bothrops jararacussu : analise estrutural do cDNA e investigações preliminares do efeito da proteina nativa sobre celulas tumorais do colon
AUTOR(ES)
Bayki Hussein Kassan
DATA DE PUBLICAÇÃO
2004
RESUMO
As lectinas presentes nos venenos ofídicos são classificadas como lectinas tipo-C e são formadas por cadeias polipeptídicas relativas ao CRD (carbohydrate recognition domain) livre, sem domínios adicionais. BJcuL é uma lectina presente no veneno da serpente Bothrops jararacussu, isolada e caracterizada em nosso laboratório. Trata-se de um homodímero, com grande afinidade à galactose e apresenta atividades tóxica sobre células tumorais e endoteliais. Este trabalho teve como proposta: (1) determinar a seqüência completa do cDNA da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu; (2) desenvolver um sistema de expressão, solubilização e purificação para a produção de BJcuL recombinante; (3) comparar a atividade da BJcuL recombinante com a nativa. Concomitante ao trabalho acima, foi também de nosso interesse: (4) investigar o efeito de BJcuL nativa sobre células tumorais do cólon quanto a proliferação/viabilidade, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O cDNA-BJcuL foi isolado da biblioteca de cDNA a partir da glândula de veneno de B. jararacussu. A seqüência do cDNA-BJcuL (GenBank acesso No. AY388642); apresentou uma região codificadora de aminoácido correspondente a BJcuL nativa e com um elevado grau de identidade com outras lectinas do tipo-C. O cDNA-BJcuL foi amplificado por PCR e ligado ao vetor de pET15b e usado para transformar E. coli BL21 (DE3). Uma proteína ,insolúvel e inativa, de 18,5 kDa foi expressa após a adição de 1 mM de IPTG. A rBJcuL foi desnaturada com 6 M de uréia, purificada e renaturada em coluna de afinidade, seguida de diálise e cromatografia em gel. A eficiência no processo de renaturação foi confirmada através de ensaios biológicos, dicroísmo circular e análise dos peptídios de rBJcuL. As células tumorais do cólon HT-29 D4 e Caco-2, após a adesão, foram incubadas com BJcuL (0 - 10 mM com 5% de FBS) por diferentes períodos (24, 48 e 72h). Ensaios de proliferação foram feitos usando o Kit BrdU-Elisa e uma interessante diminuição na incorporação de BrdU foi observada em ambas as células. BJcuL (2,5 µM) foi capaz de inibir aproximadamente 50% da proliferação em Caco-2 e 30% em HT-29 D4 em 24h. Este efeito, aparentemente não foi relacionado ao tênue desequilíbrio celular de ROS, cerca de 20% na presença de 2,5 µM de BJcuL, medido em fluorímetro (excitação em 490 nm e emissão a 538 nm) após a adição da sonda DCFH-DA. Ensaios com o reagente MTT confirmaram que BJcuL apresenta fraca citotoxicidade e não é capaz de diminuir a viabilidade dessas células. Com base nos resultados obtidos, buscamos desenvolver um estudo mais detalhado da estrutura molecular de BJcuL e suas funções, por meio da clonagem, seqüenciamento e expressão de rBJcuL, na intenção de fornecer dados para o esclarecimento das particularidades estruturais dessas proteínas
ASSUNTO(S)
clonagem molecular expressão veneno lectinas cancer
ACESSO AO ARTIGO
http://libdigi.unicamp.br/document/?code=vtls000336687Documentos Relacionados
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