Caracterização bioquimica e biologica de duas isoformas de BthTX-II:Bj-IV e Bj-V (PLA2) isoladas do veneno de Bothrops jaracussu

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2004

RESUMO

Bothrops jararacussu é uma espécie de grande importância epidemiológica no estado do Rio de Janeiro. No entanto a sua distribuição é ampla, pois pode ser encontrada nos estados de Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Sul da Bahia e também na Argentina, Paraguai e Bolívia. De um modo geral, os venenos botrópicos das espécies brasileiras foram pouco estudados tanto em relação aos seus componentes isolados como quanto ao veneno total, devido ?a falta de otimização das técnicas de purificação capazes de revelar a presença de novos componentes ou de suas isoformas. Desta forma justifica-se o interesse no isolamento e caracterização de duas novas isoformas de BthTX-II PLA2 (D49), lembrando que esta última citada é uma fração importante no veneno de Bothrops jararacussu. As isoformas foram isoladas em uma coluna de troca iônica catiônica (Protein Pack SP 5PW Waters) acoplada a um sistema LC 650 (Waters), sendo caracterizadas como isoformas de BthTX-II e denominadas como Bj-IV e Bj-V. O alto grau de pureza foi revelado ao serem re-purificadas em uma coluna de hidrofobicidade µ-Bondapack C18 acoplada a um sistema de HPLC de fase reversa, sendo eluídas em tempos de retenção muito próximos (Bj-IV 31,25 ± 0,31 minuto e para Bj-V 31,31 ± 0,28 minuto). A caracterização físico-química revelou o fato de serem isoformas, pois apresentaram vários fatores similares como, a tendência para a formação de dímeros na eletroforese com ausência de redutores, sendo que o valor de massa molecular relativa encontrada para isoformas foi de ~14 kDa, através da eletroforese em SDS-PAGE Tricina (16,5%) também, a basicidade semelhante e o alto grau de hidrofobicidade, confirmados pela composição de aminoácidos. A caracterização cinética das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) mostrou que tais isoformas são altamente estáveis e apresentam um pH ótimo ao redor de 8,0 e temperatura próxima a 37ºC. Frente a diferentes concentrações de substrato as isoformas mostraram um comportamento tipo alostérico, em nossas condições experimentais. Na ausência de Ca+2 (1Mm) e na presença de alguns íons divalentes tais como Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (na concentração de 10 mM) as isoformas Bj-IV e V foram inibidas, já na presença de Ca+2 (1mM) e com os mesmos íons divalentes citados elas mostraram uma discreta atividade. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 das isoformas, fato que sugere a possível presença de crotapotinas ?like? no veneno botrópico. A análise da composição de aminoácidos confirmou o comportamento estável de sua atividade cinética, ao mostrar um alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos, assim como a presença de 14 cisteínas envolvidas em possíveis sete pontes dissulfeto. A presença de um alto conteúdo de aminoácidos básicos como Lys, His e Arg, também confirmaram o caráter básico das isoformas, característica própria do veneno deste tipo de víperide sul americano. O estudo de homologia seqüencial da região N-terminal entre ambas isoformas e também com outras PLA2 (D49) revelou um alto grau de homologia, no entanto, foram encontradas algumas substituições que não contribuíram com diferenças significativas, tanto com relação à atividade catalítica quanto neurotóxica. O efeito neurotóxico das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) Bj-IV e V, foi avaliado usando-se duas preparações farmacológicas: nervo frênico-diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Foram encontradas diferenças em ambas preparações, pois o efeito de bloqueio da resposta contrátil evidenciou-se de maneira significativa na preparação nervo frênico-diafragma isolado de camundongo, nas concentrações empregadas (50 e 100 µg/mL), enquanto que na preparação biventer não houve efeito notório. No entanto, para a dosagem de 100 µg/mL, no caso do veneno total na preparação biventer cervicis de pintainho evidenciou-se um efeito miotóxico indireto pois, foi observada uma diminuição nas respostas contraturante dadas pela diminuição das curvas de KCl e Acetilcolina (ACh). A importância do isolamento das isoformas de BthTX-II, Bj-IV e V, está apoiada no fato de ter sido possível a obtenção destas duas novas isoformas, usando-se métodos que garantiram a manutenção da sua atividade biológica, sendo assim possível correlacionar a estrutura e a função desta família de proteínas.

ASSUNTO(S)

fosfolipase cobra

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