Caracterização cinetica da fosfotirosina proteina fosfatase de baixa massa molecular relativa do rim de carneiro. Estudo de inibidores

AUTOR(ES)

Thelma Lopes da Silva

DATA DE PUBLICAÇÃO

1999

RESUMO

A proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (20 kDa) do rim de carneiro foi purificada 1.291 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 4%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, cromatografia de troca-iônica em SP-Sephadex com eluição por íon afinidade e cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-200). A enzima 1 ?1 purificada apresentou uma A.E. de 99,4 µmol min mg . O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou uma faixa de pH ótimo de 4,0 a 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 57°C. A atividade da enzima foi pouco sensível a diversos compostos, reagentes redutores de tióis e íons metálicos, exceto pela inibição por Zn2+, CU2+, Hg2+ e Ag+ e, pela ativação por guanosina. A energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 54,5 kJ mol-1 K-1. Dos substratos testados, o pNPP, o B-Naftil-P, a FMN e a Tyr-P foram os únicos hidrolisados significativamente com Km de 0,08 mmol L-1; 0,37 mmol L-1; 10,9 mmol L-1 e 0,51 mmol L-1, respectivamente. A análise dos parâmetros cinéticos na presença de BSA 1 mg mL-1 (no meio de diluição ou no meio de reação) para os substratos pNPP e B Naftil-P, mostrou um aumento na Km e na Vmax, enquanto que para a Tyr-P a Km diminuiu. A Km para a hidrólise da FMN não foi alterada. A Ea para a hidrólise do pNPP, na presença de BSA no meio de reação ou no meio de diluição, foi similar à obtida na ausência de BSA. Nos estudos de estabilidade térmica observamos que os diversos compostos testados (Pi, BS_ Glicerol e DTT) somente protegeram a enzima quando utilizados em conjunto. Isoladamente não houve proteção significativa. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto, e inibição por vanadato (Ki, 0,18 µmol L-1), piridoxal-5-P (Ki, 3,7 µmol L-I), Pi (Ki, 0,6 mmol L-1), molibdato de amônio (Kic, 0,1 mmol L-1 e Kia, 0,2 mmol L-1) e pCMB. Assim como para o pNPP, o vanadato era um inibidor competitivo com relação a FMN e Tyr-P, com valores de Ki de 0,34 nmol L-1 e 0,48µmol L-1, respectivamente

ASSUNTO(S)

enzimas fosfatase acida

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