CARACTERIZAÇÃO DA CINÉTICA DE FORMAÇÃO E DA ESTABILIDADE DO COMPLEXO CROTAMINA-DNA VISANDO SUA UTILIZAÇÃO PARA O MELHORAMENTO DA TRANSGÊNESE ANIMAL / KINETIC CHARACTERIZATION OF TRAINING AND STABILITY OF COMPLEX crotamine-TARGETING YOUR DNA USE FOR THE IMPROVEMENT OF ANIMAL TRANSGENESIS

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

05/12/2011

RESUMO

A crotamina é um polipeptídeo catiônico, originalmente isolado do veneno da cascavel da América do Sul (Crotalus durissus terrificus), constituído por 42 aminoácidos, rico em resíduos básicos e estabilizado por três pontes dissulfeto. Esta miotoxina possui a distinta habilidade de transpor membranas lipídicas e se acumular no núcleo de diversos tipos celulares. Além disso, este peptídeo é capaz de formar complexos com moléculas de DNA através de interações eletrostáticas, podendo atuar como agente de transfecção em vários tipos de células. Contudo, estudos adicionais ainda são necessários visando melhorar a capacidade de transfecção deste peptídeo. Assim, torna-se interessante aprofundar a caracterização da formação e estabilidade dos complexos crotamina-DNA, com o intuito de otimizar a utilização desta molécula como um carreador de ácidos nucléicos. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a estequiometria, cinética de formação e estabilidade proteolítica dos complexos crotamina-DNA. Para tanto, complexos crotamina-EGFP foram formados em solução aquosa contendo 0,15 M de NaCl utilizando diferentes proporções de pEGFP-N1:crotamina. A cinética de formação e estabilidade dos complexos foram avaliadas através do ensaio de exclusão do fluoróforo e eletroforese em gel de agarose (1%). Para verificar a estabilidade dos condensados, os complexos crotamina-EGFP foram incubados com proteinase K e tripsina por 12 h à 37 C. A melhor proporção DNA:crotamina (m:m) para formação do complexo girou entorno de 1:10 a 1:40. No grupo 1:10, a crotamina foi capaz de complexar em 20 seg aproximadamente 75% do DNA disponível, e após 10 min de reação a crotamina atingiu sua capacidade de complexação máxima, sendo capaz de complexar 80% da massa de DNA. Sob estas condições, pode-se afirmar que 1 g de crotamina é capaz de complexar até 800 ng de DNA. Os complexos crotamina-EGFP foram resistentes a digestão com proteinase K após 12 h de incubação. Adicionalmente, 73% dos complexos crotamina-DNA permaneceram estáveis após 60 min de digestão, e mesmo após 180 min 55% dos condensados de DNA mantiveram sua integridade. Os complexos crotamina-DNA resistiram a temperaturas fisiológicas e mantiveram-se estáveis após estocagem por 15 dias a 4 C ou por dois meses quando armazenados a -20 C. Estes resultados nos levam a pensar que, nas melhores condições de preparo propostas neste estudo, os condensados crotamina-DNA podem ser usados de forma mais eficiente como um agente de transfecção em um programa de transgênese.

ASSUNTO(S)

transgênese complexação de dna crotamina ppcs reproducao animal crotamine ppcs complexing dna transgenesis

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