Caracterização de protease e lipase de Pseudomonas fluorescens e quorum sensing em bactérias psicrotróficas isoladas de leite / Characterization of protease and lipase from Pseudomonas fluorescens and quorum sensing in psychrotrophic bacteria isolated from milk

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

Protease e lipase produzidas por Pseudomonas fluorescens foram purificadas e caracterizadas. Os genes aprX e lipM foram clonados, seqüenciados, e expressos em Escherichia coli e apresentaram alta identidade com as seqüências disponíveis no banco de dados. A massa molecular deduzida de ambas as enzimas foi de 50 kDa. Foi verificado que cálcio é essencial para as atividades enzimáticas, uma vez que quando este íon não foi adicionado à solução de diálise nenhuma atividade foi encontrada. A protease foi ativa em ampla faixa de pH, apresentou temperatura ótima de 37 C, e maior atividade foi verificada sobre caseína e gelatina. Maior estabilidade térmica da enzima foi a 75 C por 20 s. A lipase foi mais ativa a 25 C e em pH próximo de 7,5 e p-nitrofenil-palmitato foi o substrato preferencial. Tratamentos térmicos de 65 C por 30 min e de 75 C por 1 min reduziram sua atividade para 13,2% e 25,4%, respectivamente. O mecanismo de quorum sensing (QS) em P. fluorescens foi estudado e verificou-se que as estirpes avaliadas, apesar de induzirem Agrobacterium tumefaciens NTL4 e A136, não produziram acil homoserinas lactonas (AHLs). Entretanto, a produção de auto-indutor dois (AI-2) foi detectada e a presença de dicetopiperazinas (DKPs) nos extratos químicos obtidos a partir de meio TYEP inoculado com P. fluorescens foi constatada. O rDNA 16S de seis bactérias gram-negativas isoladas de leite cru foi seqüenciado e o isolado 039 foi identificado como Pantoea sp., 059, 068 e 071 foram identificados como Hafnia alvei, 067 como Enterobacter sp. e 099 como Aeromonas hydrophila. Verificou-se que esses isolados apresentam diferenças no potencial deteriorador, na resistência a antibióticos e, após ensaios de estria cruzada em superfície de meio sólido para detecção de AHLs, constatou-se que somente Pantoea sp. não foi capaz de induzir nenhuma das estirpes monitoras utilizadas. Os ensaios de cromatografia em camada fina e a caracterização química dos extratos por espectrometria de massa confirmaram que essas bactérias produzem diferentes AHLs. O mecanismo de inibição de quorum foi utilizado e a enzima lactonase foi expressa em Enterobacter sp. transconjugante a qual foi incapaz de acumular AHLs em sobrenadante de caldo LB. O transconjugante se mostrou mais proteolítico do que a estirpe selvagem, indicando que o mecanismo de QS regula negativamente a atividade proteolítica neste isolado. Das 32 enzimas de restrição utilizadas para restringir o plasmídeo nativo (pMLM) presente nos isolados de H. alvei 068 e 071, apenas DdeI, HinfI, MspI, e RsaI foram efetivas. Além disso, não foi possível expressar a enzima lactonase em H. alvei 068 e 071 transconjugantes o que impossibilitou a avaliação da influência do mecanismo de QS sobre a atividade proteolítica desses isolados. O gene halI, que codifica a sintase de AHLs produzidas por estirpes de H. alvei, foi identificado nos isolados 059, 067, 068 e 071. Esse gene foi clonado, seqüenciado e expresso em E. coli e verificou-se que codifica uma sintase responsável pela produção de N-hexanoil-DL-homoserina lactona (C6-HSL) e N-3-oxohexanoil-L-homoserina lactona (3-oxo-C6-HSL). Das seis estirpes psicrotróficas proteolíticas avaliadas, apenas A. hydrophila foi capaz de produzir quitinase, AI-2 e de ser patogênica contra Caenorhabditis elegans.

ASSUNTO(S)

lipase raw milk protease quorum sensing leite cru pseudomonas fluorescens proteolytic psychrotrophic bacteria microbiologia de alimentos protease bactérias psicrotróficas proteolíticas pseudomonas fluorescens lipase quorum sensing

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