Comparação de métodos convencionais e reação em cadeia da polimerase em tempo real na detecção de infecção pelo citomegalovirus in vitro / Comparison of conventional methods and real-time polymerase chain reaction in the detection of the cytomegalovirus infection in vitro

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

30/09/2009

RESUMO

Introdução: Isolados clínicos do Citomegalovirus (CMV) são facilmente propagados in vitro resultando em comprometimento da monocamada celular onde o vírus foi inoculado, evidenciando assim a presença ou ausência de infecção. A cultura celular é um método clássico para detecção do CMV e foi bastante utilizada no passado. O ensaio de antigenemia, que detecta o antígeno viral pp65 do CMV, é o método mais utilizado atualmente na prática clínica, por ser mais rápido e específico para detecção da infecção ativa. Recentemente a técnica de PCR em tempo real tem sido empregada no monitoramento da infecção por meio da quantificação da carga viral por ser um método de alta sensibilidade e especificidade ao DNA viral. Sendo assim, o objetivo do estudo foi empregar testes usados no diagnóstico e monitoramento da infecção clínica à cepa padrão do CMV como protocolo para implantação em experimentos in vitro. Métodos: Monocamada de células fibroblásticas humanas confluentes e em quiescência foram inoculadas com amostras de células infectadas pela cepa adaptada em laboratório do CMV AD169. O efeito do vírus sobre a cultura foi monitorado 1 hora, 24 horas, 48 horas e 72 horas após a infecção (h.p.i) através da observação do efeito citopático. As mesmas amostras foram analisadas por antigenemia estimando-se a média de células positivas em 2x105 células e por PCR em tempo real estimando-se a média de cópias de DNA viral/Log10 presente nas amostras. Resultados: Efeito citopático foi observado pela primeira vez 24 h.p.i, evidenciando que o início das mudanças morfológicas ocorreu precocemente. Esse efeito tornou-se mais intenso após 72h. O ensaio de antigenemia evidenciou presença de infecção ativa pelo padrão de marcação do antígeno viral pp65 encontrado no núcleo das células infectadas, enquanto que a PCR em tempo real evidenciou o número de cópias de DNA viral nos diferentes tempos de infecção. Antigenemia apresentou uma média 57 56 células positivas 1h.p.i. O pico da infecção foi alcançado 24h.p.i com um aumento significativo da média para 2.381 168 (P<0.05 versus 1h.p.i), mantendo-se elevado 48h.p.i, mostrando uma média de 2.012 352. Entretanto, os níveis de antigenemia diminuem significativamente 72h.p.i para 262 5 (P<0.05 versus 48h.p.i). Assim como na antigenemia, observou-se aumento significativo da carga viral de 1 h.p.i para 24 h.p.i, sendo uma média de DNA viral detectado 11.30 0.30 e 11.96 0.09, respectivamente (P<0.05 versus 1h.p.i). Os níveis de DNA viral se mantêm elevados 48h.p.i, sendo detectada uma média de 12.33 0,26. Após esse período, carga viral cai significativamente para 11.57 0.06 (P<0.05 versus 48h.p.i). Não foi encontrada correlação entre os métodos quantitativos de antigenemia e PCR em tempo real. Conclusão: Os três métodos utilizados, isolamento viral, antigenemia e PCR em tempo real evidenciaram o sucesso da infecção in vitro pelo CMV por meio de mudanças cito-morfológicas, detecção de antígeno viral específico e carga viral por detecção do DNA viral, respectivamente. A técnica de PCR se mostrou a mais sensível na detecção viral em relação às demais técnicas. Embora sejam métodos sensíveis e específicos, consideramos a necessidade da titulação viral em quaisquer ensaios experimentais in vitro.

ASSUNTO(S)

citomegalovirus cultura de vírus efeito citopatogênico viral proteínas da matriz viral carga viral reação em cadeia da polimerase nefrologia cytomegalovirus viral culture viral cytopathogenic effect viral matrix protein viral load polymerase chain reaction

ACESSO AO ARTIGO

Documentos Relacionados