Desenvolvimento de novas abordagens moleculares baseadas em PCR (reaÃÃo em cadeia da polimerase) para detecÃÃo genero-especÃfica de Plasmodium

AUTOR(ES)

Lilian Maria Lapa Montenegro

DATA DE PUBLICAÇÃO

2002

RESUMO

OligonucleotÃdeos foram construÃdos com base na sequÃncia primÃria do gene codificando o rRNA de Plasmodium para amplificar DNA de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, de maneira gÃnero-especÃfica. TrÃs sistemas de PCR foram utilizados: PCR simples, âhemi-nestedâ PCR convencional e âhemi-nestedâ PCR em um Ãnico tubo, desenvolvidos em nosso laboratÃrio. Na PCR simples, composta de 30 ciclos, foram utilizados os oligonucleotÃdeos GJ1 e HR842 (20 pmol/50μl), jà testados por nosso grupo. Na âhemi-nested PCR convencional utilizou-se trÃs oligonucleotÃdeos (GJ1, PGFO3 e HR842), em duas reaÃÃes sequenciais, sendo o PGFO3 construÃdo durante o desenvolvimento do presente trabalho, visando a detecÃÃo do gÃnero Plasmodium. O par GJ1 e HR842 foram utilizados como oligonucleotÃdeos externos na primeira reaÃÃo, e o PGFO3 como interno, ancorado ao HR842 na segunda reaÃÃo. A âhemi-nestedâ PCR em um Ãnico tubo consistiu em 60 ciclos (92ÂC, 30s; 58ÂC, 30s e 72ÂC, 45s), e concentraÃÃes limitantes de oligonucleotÃdeos externos (4 pmols/50μl) participavam da PCR sem competiÃÃo com os oligonucleotÃdeos internos durante os primeiros 15 ciclos da reaÃÃo e 40 pmol/50μl de primers internos (imobilizados na face interna da tampa do microtubo) foram introduzidos na PCR no 16 ciclo. As concentraÃÃes dos outros componentes da reaÃÃo foram as mesmas utilizadas nas reaÃÃes convencionais de PCR. Observou-se que a quantidade mÃnima de DNA genÃmico detectada pela PCR simples, âhemi-nestedâ PCR e âhemi-nestedâ PCR em um Ãnico tubo foi de 10 pg; 0,01 pg e 0,1 pg, respectivamente. Apesar da âhemi-nestedâ PCR em um Ãnico tubo ter sido menos sensÃvel que a âheminestedâ PCR convencional, à muito mais simples e conveniente, jà que o risco de contaminaÃÃo cruzada à bem menor. Esses sistemas moleculares de diagnÃstico podem ser usados em situaÃÃes quando se requer uma alta sensibilidade e especificidade, tais como na avaliaÃÃo da eficiÃncia de quimioterapia, detecÃÃo precoce de infecÃÃo e prevenÃÃo de transmissÃo a partir de pacientes hipoparasitÃmicos

ASSUNTO(S)

detecÃÃo de plasmodium biofisica abordagens moleculares pcr

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