Desenvolvimento de painéis multiplex de marcadores microssatélites para seleção assistida para qualidade de grãos de arroz (Oryza sativa L.)

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

O sucesso de uma variedade de arroz depende cada vez mais da qualidade dos seus grãos. A culinária brasileira exige, em geral, variedades com grãos longos, finos e alta qualidade de características físico-químicas, resultando em grãos mais soltos após a cocção. Qualidade de grãos é uma característica complexa, controlada por vários genes. O amido representa 90% do peso seco do grão beneficiado de arroz. A estrutura do amido é composta por dois tipos de polissacarídeos: amilose e amilopectina. Portanto, a composição de amilose e amilopectina no endosperma influencia diretamente a qualidade do grão de arroz. As enzimas da via metabólica de amido são codificadas por genes distribuídos em vários cromossomos, como os genes da ADP-glucose pirofosforilase, da sintase de amido, e das enzimas de ramificação e de desramificação de amido. Variação alélica nestes genes ou na região destes genes, em desequilíbrio de ligação com as sequências codantes que afetam a produção de amido pode, em tese, ser usada para selecionar indiretamente para o aumento da qualidade de grãos de arroz. Isto é importante porque a avaliação de qualidade de grãos em etapas iniciais do programa de melhoramento é, na prática, difícil de ser realizada. Os procedimentos de análise de qualidade de grãos (teor de amilose aparente, temperatura de gelatinização; coesividade, textura, etc.) demandam razoável quantidade de sementes, em geral não disponíveis nas primeiras gerações do programa de melhoramento. E mesmo na etapa final, quando a quantidade de sementes é suficiente, a fenotipagem para qualidade de grãos é complexa e intensiva em mão-de-obra. Portanto, a seleção indireta baseada em marcadores moleculares pode ter efeito significativo no melhoramento para qualidade de grãos se genótipos superiores puderem ser selecionadas nas etapas iniciais do programa. Este trabalho teve por objetivo desenvolver painéis de marcadores microssatélites situados na região de genes da via metabólica de amido para uso em seleção assistida para qualidade de grãos. O objetivo foi desenvolver painéis de marcadores microssatélites com as seguintes características: (1) capacidade de amplificação simultânea de alelos em quatro ou mais locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido; (2) qualidade e repetibilidade dos produtos de PCR em análise de polimorfismo em seqüenciadores de DNA; (3) alto conteúdo informativo (PIC) e diversidade gênica esperada dos marcadores selecionados; (4) análise combinada de pelo menos uma dezena de locos da via metabólica de amido, ou seja, o conjunto de painéis multiplex deve possibilitar a análise indireta de polimorfismo de DNA na região de vários genes selecionados. Para isto, foram identificadas milhares de sequências microssatélites na região de 11 genes da via metabólica de amido. Nestas regiões genômicas foram selecionados dois microssatélites acima e dois abaixo de cada gene, a uma distância máxima 200 kpb da sequência codificante. Quarenta-e-quatro microssatélites, sendo quatro na região de cada um dos 11 genes, distribuídos em seis cromossomos, foram selecionados para análise. Iniciadores (primers) de PCR foram desenhados, sintetizados e testados para cada marcador. Deste total, trinta e quatro marcadores microssatélites foram selecionados para análise. Após testar diferentes combinações de marcadores para amplificação alélica simultânea, foram desenvolvidos três painéis multiplex (dois tetraplexes e um pentaplex), com capacidade de genotipagem de 11 locos microssatélites ligados a genes da via metabólica de amido. Um painel adicional com quatro marcadores, capaz de substituir na íntegra os marcadores de um dos tetraplexes, também foi desenvolvido. Cada painel possui pelo menos um loco em comum com os demais (SBE-IIa.H4), permitindo o controle de genotipagem entre painéis e minimizando a possibilidade de erro humano durante os ensaios. O PIC médio estimado dos locos selecionados foi 0,609, variando de 0,128 a 0,891, e a Probablilidade de Exclusão combinada dos painéis multiplexes selecionados foi de 0,9965-Painel J; 0,993-Painel K; 0,999 Painel L e 0,9992 Painel M. Os painéis multiplexes foram validados para seleção para qualidade de grãos de arroz através de mapeamento de QTLs de componentes de qualidade de grãos e através de testes independência entre fenótipo e genótipo em amostras de acessos do Banco de Germoplasma de Arroz tomadas ao acaso. O mapeamento de QTLs foi realizado em uma população de linhagens puras recombinantes (RIL) derivada do cruzamento entre as cultivares Chorinho e Amaroo. Cinco (AGPS2.C4, Waxy.F4,SBE-I.G3,SBE-IIb.I3, SSIIa.L2) dos 34 locos microssatélites desenvolvidos apresentaram segregação alélica nesta população. A população foi fenotipada para sete componentes de qualidade de grãos: Teor de Amilose (TA), Temperatura de Gelatinização (TG), Centro Branco (CB), Largura do Grão (LG), Comprimento do Grão (CG), Rendimento de Benefício (RB) e Rendimento de Grãos Inteiros (RI). Foram detectados QTLs de qualidade de grãos na região dos microssatélites Waxy.F4 (Teor de Amilose e Centro Branco) e SSIIa.L2 (Temperatura de Gelatinização) no cromossomo 6, e AGPS2.C4 (Largura do Grão) no cromossomo 8. Outros QTLs de componentes de qualidade de grãos foram detectados para Comprimento do Grão (cromossomo 7), Largura do Grão (cromossomos 2, 7 e 9) e Centro Branco (cromossomos 1 e 11). Uma amostra de 23 acessos do Banco de Germoplasma foi caracterizada para os sete componentes de qualidade de grãos já descritos e genotipada com os 34 marcadores microssatélites. Em testes de independência entre genótipo e fenótipo, os marcadores AGPS1.A1, AGPS1.A2, Dbe.Pul.E3, SBE-IIa.H2, SBE-IIa.H3 e SBE-IIb.I2 permitiram a identificação dos acessos do Banco de Germoplasma com mais do que 22% de Teor de Amilose com grande acurácia. Merece destaque o marcador SBE-IIb.I2, com uma eficiência de 82% na identificação de acessos com alto e baixo Teor de Amilose no Banco de Germoplasma. Todos os acessos com genótipo 154/154 no marcador AGPS1.A1 apresentaram Teor de Amilose menor do que 22%. Para Largura do Grão, grande parte dos acessos testados com o marcador Dbe.Pul.E3 possui um índice de Largura do Grão maior do que 5,0 (largo a extra-largo). Já o marcador AGPS2.C4 permitiu a identificação da maioria dos acessos de grãos finos e extra-finos, com índice Largura do Grão menor do que 5,0 (genótipo 184/184). Os dados de mapeamento de QTLs na população RIL Chorinho x Amaroo e de avaliação genética de amostras do Banco de Germoplasma de arroz permitem concluir que os marcadores microssatélites desenvolvidos na região dos genes AGPS1, AGPS2,DBE-Pullulanase, Waxy, SBE-IIa e SSIIa da via metabólica de amido são informativos para emprego em seleção assistida para qualidade de grãos de arroz.

ASSUNTO(S)

gelatinization temperature microssatélite temperatura de gelatinização grain quality marker assisted slection seleção assistida microssatelite teor de amilose arroz - cultivos agrícolas; arroz - melhoramento genético; bioteconologia agrícola - amido starch qualidade de grãos outros amylose content

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