Estabelecimento e cultura in vitro de raizes normais e transformadas com Agrobacterium rhizogenes para estudos de terpenos de interesse em genotipo superior de Artemisia annua L

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2002

RESUMO

As plantas do gênero Artemisia se constituem numa rica fonte de sesquiterpenos, os quais têm recebido grande atenção dos pesquisadores devido a sua diversidade química e biológica. A contínua investigação da presença de compostos secundários de interesse bem como de protocolos eficientes para a viabilização e otimização da produção em larga escala dos mesmos são extremamente recomendados e necessários para a exploração desta rica fonte de novos agentes quimioterapêuticos e agriculturaís. A planta alvo deste estudo foi o florido CPQBA 2/39 x PL5 da espécie Artemisía annua, o qual foi obtido pelo programa de melhoramento genético da MEDIPLANT e do CPQBA. Com a finalidade de se manter algumas características desejáveis deste genótipo superior, tais como alta produção de biomassa e de artemisinina, um sesquiterpeno com ação antimalárica, o presente trabalho teve início a partir de um único explante meristemático, o qual foi excisado de uma única planta matriz do híbrido melhorado cultivada nos campos experimentais do CPQBA. Após o desenvolvimento do explante meristemático selecionado, este foi micropropagado até a obtenção de um banco de material homogêneo in vitro com número adequado de plantas sadias, as quais serviram como fontes de explantes para os experimentos posteriores. Foram desenvolvidas metodologias para a iniciação, estabelecimento e cultivo de raízes tanto normais como transformadas com duas cepas de Agrobacterium rhizogenes (15834 e 8196). A confirmação do caráter transgênico das raízes foi obtida por "Dot Blot", um método rápido e eficiente de triagem que permitiu uma análise molecular qualitativa. Estudos relacionados com a formação de calos e a morfogênese in vitro das raízes transformadas obtidas com ambas as cepas também foram realizados. Os extratos dos materiais vegetais foram analisados por cromatografia gasosa acoplado a um espectrômetro de massas (CGIEM) de acordo com metodologia analítica e de alta sensibilidade para detecção de terpenos que foi desenvolvida por pesquisadores do CPQBAlUNICAMP. Os extratos dos calos obtidos bem como das raízes transformadas e normais estabelecidas e cultivadas em diferentes meios de cultura e sobre diferentes condições fotoperiódicas foram analisados quimicamente para a avaliação de alguns terpenos de interesse, tais como: artemisinina e ácido artemisinínico, além de dois outros compostos com forte atividade antiulcerogênica: dihídro-epideoxí-artenuína B edeoxiartemisinína. Os resultados destas análises revelaram que nenhum dos terpenos mencionados estavam presentes nos extratos dos calos e das raízes transformadas analisadas. Os cromatogramas dos extratos das raízes normais cultivadas em meio MS líquido desprovido de fitorreguladores revelaram a presença do composto antiulcerogêníco dihídro-epideoxi artenuína B e de um outro composto ainda não identificado. Pelas características do padrão de ttacionamento do espectro obtido por CG/EM, podemos sugerir que este composto não identificado é também um terpeno, no entanto a confirmação desta hipótese deverá ser objetivo de trabalhos futuros. As condições fotoperiódícas de cultivo influenciaram na produção destes dois terpenos, sendo que a produção do composto não identificado foi inversamente proporcional à produÇão de dihídro-epideoxí-artenuína B, ou seja, sob condição de escuro contínuo, quando díhidro-epideoxi-artenuína B foi intensamente produzido, o composto não identificado foi detectado em pequenas proporções, e, sob fotoperíodo de 16 horas, o inverso ocorreu. A quantificação de dihídro-epideoxi-artenuína B por Cromatografia gasosa acoplado a um Detector de Ionização de Chamas (CG/DIC) revelou um aumento de aproximadamente cinco vezes na produção deste composto pelas raízes normais cultivadas sob condição de escuro contínuo em relação às raÍzes cultivadas na presença de 16 horas de luz. A presença de auxína no meio MS mantido sob condições de 16 horas de luz resultou em alta produção do composto não identificado pelas raizes normais, enquanto que a produção de dihidro-epideoxi-artenuína B não foi detectada nestas raízes através das metodologias empregadas. Os terpenos de interesse também foram estudados quanto as suas atividades antimicrobianas através de ensaios bioautográficos. Para os testes biológicos foram utilizados os seguintes microrganismos: Bacillus subtilis, Salmonella hoterasuis, Micrococcus luteus, Rhodococcus equi, Escherichía colí, Staphylococcus aureus, Candida albícans, Pseudomonas aeruginosa. Os resultados destes testes mostraram que nenhum dos terpenos de interesse apresentou atividade antifúngica com a linhagem de Ccmdida a/bicans. A atividade antibacteriana foi comprovada para artemisinina e para o ácido artemisinínico, com as linhagens das bactérias B. subitílís, R equí, S. aureus e E. coZi. O composto dihidro-epideoxi artenuína B apresentou atividade antibacteriana com as linhagens das bactérias B. subtil is, M luteus e S. aureus e o composto deoxiartemisinina com as linhagens B. subtilis, R equi, M luteus e S. aureus

ASSUNTO(S)

raizes - cultivo fertilização in vitro artemisia sesquiterpenos

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