Evaluation of DNA extraction methods of Cryptosporidium spp. in feces and comparison of nested PCR with sucrose centrifugal flotation method / Avaliação de métodos de extração de DNA de Cryptosporidium spp. em amostras fecais e comparação de nested PCR com o médodo coproparasitológico de centrífugo-flutuação em sacarose

AUTOR(ES)

Mikaela Renata Funada

DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

O desempenho de seis métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes foram avaliados pela nested PCR do gene SSU rRNA. Os métodos consistem na combinação com pequenas variações de duas técnicas para a liberação de esporozoítos (indução de excistamento/E ou choque térmico/C) e três técnicas de purificação de DNA (fenol-clorofórmio/F, GuSCN-sílica/S ou kit QIAmp DNA Stool Mini/K). Para a avaliação da sensibilidade analítica, os testes foram realizados a partir de diluições seriadas de oocistos purificados, na ausência e na presença de 100 μl de fezes bovinas. A sensibilidade diagnóstica foi avaliada pela comparação com o método microscópico de centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro) em 15 amostras fecais de diferentes hospedeiros naturalmente infectados. Na ausência de fezes, foram avaliados apenas os métodos EF, ES, CF e CS, sendo que EF apresentou sensibilidade analítica superior, possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Na presença de fezes, os métodos EF, EK e CK apresentaram desempenhos equivalentes, com sensibilidade de 104 oocistos. As maiores sensibilidades diagnósticas foram obtidas pelos métodos EK e CK, que possibilitaram a detecção de 13 (86,7%) das 15 amostras. Devido à alta sensibilidade analítica de EF em amostras purificadas, avaliou-se sua sensibilidade diagnóstica em amostras de oocistos purificados pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, obtendo-se 100% de detecção. A presença de inibidores nas amostras fecais reduziu fortemente a sensibilidade das reações de PCR a partir de DNA extraído pelos métodos avaliados, sendo recomendável o emprego de técnicas de purificação de oocistos previamente à extração de DNA. Os resultados apontam para uma melhor eficiência dos métodos de indução de excistamento e kit QIAmp DNA Stool Mini.

ASSUNTO(S)

cryptosporidium cryptosporidium feces dna (extração) polymerase chain reaction diagnóstico (métodos) diagnosis (methods) dna (extraction) reação em cadeia polimerase fezes

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