New mutations in CYP21A2 and CYP11B1 genes and their effects upon the enzimatic activities / Mutações novas dos genes CYP21A2 e CYP11B1 e suas alferações na atividade enzimatica

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

A causa mais freqüente de hiperplasia congênita da adrenal (HCA) é a deficiência da enzima CYP21A2 responsável por cerca de 90% dos casos, seguida da deficiência de CYP11B1, a qual é responsável por 5-8%. A deficiência de CYP21A2 apresenta diferentes sintomas clínicos, que podem variar de uma forma leve não clássica (NC) a uma forma grave clássica, dividida em virilizante simples (VS) e perdedora de sal (PS). Enquanto a deficiência de CYP11B1 é classificada nas formas clássica e não-clássica, dependendo da gravidade do fenótipo. As diferentes formas destas deficiências estão associadas a mutações distintas ou a combinação de mutações nos genes, sendo estas mutações provenientes dos genes homólogos ou não. O primeiro objetivo desta tese foi identificar novas mutações em alelos de 31 pacientes. As variantes protéicas novas p.G56R, p.L107R e p.L142P e, as raras p.H62L, p.H62L+p.P453S e p.R408C do gene CYP21A2 foram expressas para comparar as atividades da enzima CYP21A2 nas suas formas normal e mutantes. Foi objetivo, também, estudar através da técnica de mini-genes as possíveis alterações no processo de splicing para as variantes IVS2+5G>A, IVS2-2A>G, IVS4- 15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E do gene CYP21A2 e para a variante g.1753G>A do gene CYP11B1. O estudo da atividade enzimática do gene CYP21A2, realizado pela técnica de mutagênese sítio-dirigida, demonstrou que as mutações p.L107R, p.L142P e p.R408C reduziram a atividade enzimática para valores praticamente nulos, classificando-as como responsáveis pela forma PS. A alteração p.G56R apresentou uma quantidade mínima de conversão de progesterona em desoxicorticosterona, quantidade suficiente para evitar a perda de sal, sendo considerada clássica associada à forma VS. A mutação p.H62L foi encontrada no mesmo alelo que a mutação p.P34L, em uma das pacientes da casuística desse trabalho, ambas inseridas num gene quimérico portador da deleção de 30 Kb. A mutação p.H62L também foi encontrada em associação com a mutação p.P453S, em dois pacientes de origem Escandinava. No estudo funcional a mutação p.H62L reduziu parcialmente a atividade enzimática. Os resultados cinéticos classificaram essa mutação como relacionada à forma NC da deficiência de CYP21A2. Em combinação com a mutação p.P453S, observou-se um sinergismo, uma vez que reduziu a atividade da enzima para a faixa limítrofe entre NC e VS. A investigação no processo de splicing utilizando a técnica de minigenes para as alterações no gene CYP21A2 indicou que a variação IVS2+5G>A causa a perda do exon 2 na formação do mRNA, sendo relacionada à forma PS. Da mesma forma, a variação IVS2- 2A>G foi classificada como associada à forma PS, pois inseriu no mRNA 19 bases provenientes do intron 2 na junção exon2-exon3, o que modificou o frame de leitura do mRNA criando um códon de parada prematura. Por outro lado, ficou demonstrado que as variações IVS4- 15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E não interferem no processamento normal do mRNA do gene CYP21A2. No caso da alteração g.1753G>A no gene CYP11B1, que foi classificada como responsável pela forma clássica da deficiência de CYP11B1, o estudo de mini-gene indicou a perda dos últimos 45 nucleotídeos do exon 4, criando um códon de parada prematura. A elucidação do papel funcional e estrutural das mutações nos genes estudados permitiu o correto estabelecimento da correlação genótipo-fenótipo na maioria dos pacientes com HCA estudados.

ASSUNTO(S)

alternative splicing hiperplasia supra-renal congenita site-directed mutagenesis mutagenese sitio-dirigida congenital adrenal hyperplasia splicing alternativo

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