O complexo lipolítico de Metarhizium anisopliae e sua relação com o processo de infecção de hospedeiros artrópodes

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agentes biológicos para o controle de muitos artrópodes-praga. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados principalmente em fungos patogênicos. Neste trabalho, investigamos o complexo lipolítico de M. anisopliae relacionado com a infecção de hospedeiros artrópodes. M. anisopliae foi eficiente no controle da aranha marrom, Loxosceles sp., uma importante praga com grande impacto na saúde pública e também um modelo aracnídeo alternativo para bioensaios. Uma mortalidade de 100% para indivíduos juvenis foi observada em 12 dias e 9 dias para adultos usando 109 conidios.mL-¹ com valores de LT50 de 8,35 dias e 6,57 dias respectivamente. Além disso, diferentes fontes de carbono, como constituintes da cutícula de artrópodes, influem na secreção de enzimas lipolíticas por M. anisopliae. Valores altos de atividade lipolítica foram induzidos em meios de cultura contendo constituintes do tegumento de artrópodes, quitina e estereato de colesteril. Em zimogramas, muitas bandas de atividade lipolítica foram observadas em todos os meios de cultura testados. Uma lipase de superfície de esporo de M. anisopliae (MASSL) fortemente associada à superfície do esporo do fungo foi purificada e caracterizada. Análises eletroforéticas mostraram que a massa molecular desta lipase é ~66 kDa e o pl 5,6. O seqüenciamento da proteína revelou que os peptídeos identificados em MASSL compartilham identidade com muitas lipases ou sequências relacionadas à lipases. A enzima foi capaz de hidrolisar muitos substratos com alguma preferência por esteres com cadeia de ácido graxo curta. Os valores de Km e Vmax para os substratos ρNP palmitato (ρNPP) e ρNP laurato foram respectivamente 0,474 mM and 1,093 mMol.min-¹.mg-¹ e 0,712 mM e 5,696 mMol.min-¹.mg-¹. A temperatura ótima da lipase purificada foi de 30 °C e a enzima foi mais estável em valores de pH mais ácidos (pH 3–6). A atividade de MASSL foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Co²+ e inibida por Mn²+. O efeito inibitório na atividade exercido por EDTA e EGTA foi limitado, enquanto o inibidor de lipase ebelactone B inibiu completamente MASSL. Metanol 0,5% aparentemente não afetou a atividade enquanto β-mercaptoetanol ativou a enzima. Anticorpos contra MASSL foram produzidos e análises de western blot sugerem que o anticorpo é específico para lipase. Este trabalho também apresenta o perfil de atividade de lipase durante o processo de infecção do carrapato Rhipicephalus microplus e o efeito do inibidor de lipase ebelactona B na infecção. Durante a exposição dos carrapatos aos esporos a atividade de lipase aumenta de 0,03 a 0,312 U usando ρNPP como substrato. Em zimogramas, bandas de atividade lipolítica foram detectadas em carrapatos tratados com esporos sem inibidor. O tratamento prévio dos esporos com o inibidor de atividade de lipase inibiu completamente a atividade lipolítica e preveniu a infecção do hospedeiro R. microplus. Os resultados apresentados neste trabalho são avanços importantes na elucidação da função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae.

ASSUNTO(S)

metarhizium anisopliae artrópodes

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