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Pre-purificação por eletrocoagulação de proteina sGFP produzida em folhas de Nicotiana benthamiana transgenica / Pre-purification of recombinant sGFP produced in Nicotiana benthamiana leaves by electrocoagulation

Goran Robic

A técnica de eletrocoagulação tem sido usada basicamente em tratamento de água potável e águas residuais. Neste trabalho propusemos o uso desta técnica na recuperação e purificação (RPB) de proteínas recombinantes produzidas em plantas geneticamente modificadas. O desafio principal da RPB de uso de plantas como biorreatores é a presença de clorofila e polifenóis nos seus extratos, que causam precipitação e desnaturação das proteínas de interesse, além de danificarem membranas e géis de separação. Portanto, a remoção destes compostos é essencial. No presente trabalho estudou-se a aplicação de eletrocoagulação para clarificar extratos de folhas de Nicotiana benthamiana transgênica removendo a clorofila e polifenóis, sem remover a proteína recombinante sGFP (proteína verde fluorescente sintética). Primeiramente foi necessário desenvolver um método de determinação e quantificação de sGFP baseado na fluorescência intrínseca desta proteína. Os problemas com a fluorescência de fundo presente nos extratos de folhas de N. benthamiana e o aumento de intensidade da fluorescência da sGFP nestes extratos – provavelmente o resultado de dimerização de moléculas de sGFP promovida por composto(s) do extrato – por nós observados, tinham que ser resolvidos. Diluição de 20 vezes dos extratos contendo sGFP com solução de uréia 6 mol/L em fosfato de sódio 50 mmol/L pH 7,00 eliminou completamente estas duas interferências. Os estudos da eletrocoagulação foram iniciados desenvolvendo-se dois modelos de remoção de compostos biológicos de soluções aquosas por esta técnica. Os modelos desenvolvidos são baseados na formação de complexos entre o composto e o gel de hidróxido de alumínio ou a partição do composto entre a fase aquosa e fase do gel de hidróxido de alumínio. Análises teóricas e experimentais revelaram que os parâmetros relevantes na remoção destes compostos são a corrente utilizada – que afeta a taxa de formação de hidróxido de alumínio – e o pH da eletrocoagulação – que afeta a carga tanto do gel formado como dos compostos a serem removidos. Gel de hidróxido de alumínio produzido a pH 8,0 apresentou alta eficiência em remover clorofila e polifenóis dos extratos de folhas de N. benthamiana não-transgênica, ao passo que somente uma pequena porção de proteínas nativas foi removida. Portanto, o gel de hidróxido de alumínio produzido nesta condição foi adicionado a extratos de N. benthamiana transgênica contendo sGFP. A remoção de 99,7% clorofila, de 88,5% dos polifenóis e de 38,4% de proteína total do extrato foi observada sem remoção da sGFP (fator de purificação de 1,6). Portanto, a eletrocoagulação pode também ser usada como técnica de pré-purificação de proteínas recombinantes e ao mesmo tempo como método de clarificação de extratos de folhas.