Proteômica e peptidômica aplicadas ao estudo da defesa de plantas de tomate à injúria mecânica / Proteomics and peptidomics applied to study the defense of tomato plants of the mechanics injury

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

Plantas são expostas a estresses múltiplos, e suas respostas definirão sua capacidade de sobrevivência. Diferentes vias de resposta são induzidas pela ativação ou inibição de diversas proteínas, quando células de plantas são submetidas a alguma forma de estresse biótico ou abiótico. Estudos proteômicos estruturais e funcionais buscam avaliar os níveis de inibição, superexpressão e síntese diferencial dessas proteínas, focalizando o monitoramento e a análise de suas propriedades, e os seus envolvimentos nas vias de sinalização e de defesa de plantas contra estresses. A grande dificuldade desses estudos é que na maioria das vezes, a síntese diferencial de proteínas e peptídeos é induzida em pequenas quantidades, representando baixas concentrações na célula. Além disso, o proteoma celular é representado por várias proteínas constitutivas, expressas em altas quantidades para o desenvolvimento das funções celulares normais, sendo, portanto, de alta complexidade. Essa alta complexidade e alta concentração podem dificultar a visualização dessas biomoléculas induzidas por meio dos estudos proteômicos e peptidômicos. Para superar essa dificuldade de visualização é necessário o desenvolvimento de ferramentas bioquímicas que possibilitam o enriquecimento dessas amostras, permitindo, assim, a visualização e a identificação de um maior número possível de proteínas e peptídeos diferencialmente sintetizados. Para avaliar o proteoma e o peptidoma diferencial de folhas de plantas de tomate submetidas a estresse por injúria mecânica, plantas de tomateiro Santa Cruz Kada foram cultivadas por 28 dias, em casa-de- vegetação, e foram feridas por esmagamento do limbo foliar por meio de alicate (aprox. 0,5 cm de diâmetro). Folhas sem ferimento (SF) e folhas coletadas 0, 1, 2 e 7 dias após os ferimentos foram estocadas a -80oC. A extração foi realizada por maceração, na presença de N2 líquido, em tampão acrescido de inibidores de proteases e polivinilpolipirrolidona (PVPP). Os extratos foram centrifugados (20.000 g, 4oC, 25 min) e os sobrenadantes, denominados de Extrato Solúvel (ES). Os precipitados foram lavados e uma nova fração protéica foi extraída em presença de LiCl, sendo denominado Extrato de Parede Celular (EP). Os extratos solúveis foram utilizados para avaliar a atividade das enzimas indicadoras do estado de indução de resistência, lipoxigenases (LOX), peroxidases (PO), fenilalanina amônia-liase (PAL), quitinases e β-1,3-glucanases. Alteração nas atividades dessas enzimas indicou que o material-fonte de proteínas a ser usado nas análises proteômicas e peptidômicas diferenciais apresentava síntese diferencial de proteínas em resposta ao estresse envolvido. No primeiro experimento, EP foi fracionado com (NH4)2SO4 (30-75% sat.) e o precipitado recuperado foi ressuspendido em tampão de extração e avaliado quanto à síntese diferencial de proteínas utilizando cromatografia líquida multidimensional (MDLC), combinando cromatografias offline de exclusão molecular e de fase reversa. O pool GF4 (pós- exclusão molecular) apresentou o maior número de picos protéicos/peptídicos diferencialmente sintetizados. Foram identificadas massas moleculares nas frações RPGF4 correspondentes aos cinco tratamentos em diferentes tempos de eluição. Os protocolos permitiram a obtenção de 5 frações peptídicas purificadas (SF - 9.965.348 Da; 0-Dia - 5.586,304 Da; 1-Dia - 2.835,539 Da; 2-Dias - 1.611,931 Da e 7-Dias - 9.980,078 Da) e duas frações com duas massas. Análises de peptide mass fingerprint não demonstraram homologias significativas, apenas indicaram a associação desses peptídeos com mecanismos de defesas. Foi obtida uma seqüência de nove resíduos de aminoácidos (E-N-G-EI/L-V- D-I/L-N) por espectrometria de massa MS/MS de um peptídeo tríptico (2.211,399 Da) da amostra RPGF4 7-Dias (9.980,349 Da). No segundo experimento, ES e EP foram fracionados por (NH4)2SO4 (30-75% sat.). O precipitado recuperado foi resusspendido e fracionado por ultrafiltração, obtendo-se amostras protéicas em faixas de massas moleculares de 1 a 10, 10 a 30 e acima de 30 kDa, denominadas ES1-10, EP1-10, ES10-30, EP10-30, ES30 e EP30, respectivamente. Cada uma dessas frações foi submetida à análise proteômica e peptidômica, por cromatografia líquida multidimensional (MDLC) offline, utilizando-se colunas de troca aniônica e fase reversa como dimensões de separação. Os perfis cromatográficos dos tratamentos 0, 1, 2 e 7-Dias, quando comparados com o controle (SF), apresentaram picos diferenciais em todas as frações analisadas que continham diferentes faixas de massas moleculares. Após a separação por fase reversa, a fração ES30 do tratamento 7-Dias apresentou picos protéicos diferenciais quando comparados com SF. A fração ES10-30 do tratamento 2-Dias se destacou pelo maior número de picos protéicos diferenciais gerados, enquanto que para a fração ES1-10, o maior número de picos diferencialmente sintetizados foi evidenciado no tratamento 1 dia após os ferimentos. A eficiência da purificação de picos diferencialmente sintetizados associados a proteínas ligadas à indução de resistência possibilitou a análise desses picos por espectrometria de massa. Foram identificadas massas de 8.214,794, 1.612,940 e 5.724,462 Da para picos purificados a partir do extrato solúvel do tratamento 1-Dia. Já para EP1- 10 foram identificadas massas de 8.224,107; 8.214,794 e 1.567,804 Da para os tratamentos SF, 0 e 2-Dias, respectivamente. Essas amostras purificadas foram submetidas à proteólise limitada por tripsina, reduzidas e alquiladas, e as massas moleculares do perfil peptídeos foram analisadas em bancos de dados de peptide mass fingerprint, entretanto sem sucesso na obtenção de seqüências peptídicas. Os protocolos de fracionamento propostos permitiram a obtenção, com sucesso, de frações purificadas, com destaque para as vantagens obtidas pelo uso da ultrafiltração para o fracionamento prévio das amostras, sobretudo das amostras de baixa massa molecular (1 a 10 kDa), tanto para os extratos de parede celular quanto para os extratos solúveis. A intensidade dos valores de absorvância indicados nos perfis cromatográficos de fase reversa, tanto para o primeiro quanto para o segundo experimento, permitiu a observação de um grande número de picos diferenciais. Porém, em função da expressão em baixas concentrações, apenas a identificação das massas moleculares foi possível, não tendo sido obtido sucesso na obtenção de seqüências. Há necessidade de acúmulo de material protéico em alto grau de purificação para os trabalhos seguintes de identificação de seqüência e análise funcional.

ASSUNTO(S)

proteomics tomate proteômica peptidomics peptidômica tomato proteinas

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