Seleção e avaliação funcional de fatores potencialmente envolvidos com interações entre plantas e nematóides parasitas

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

Os fitonematóides do gênero Meloidogyne estão entre os mais prejudiciais para a economia agrícola mundial. Estes fitoparasitas são responsáveis por 95% de todas as perdas causadas por nematóides das galhas no mundo e por perdas estimadas em mais de US$ 80 bilhões/ano. A gravidade das perdas causadas por meloidoginoses tem estimulado, há décadas, programas de melhoramento direcionados na obtenção de variedades resistentes sem que, no entanto resultados satisfatórios tenham sido atingidos. Por outro lado, as técnicas de genômica funcional se constituem em importantes ferramentas na descoberta de função e identificação de genes essenciais para o fitoparasitismo, cujos produtos gênicos podem ser utilizados como moléculas alvo para o controle de fitonematóides. A cultura do algodão (Gossypium hirsutum) sofre perdas significativas na sua produção, devido ao ataque de fitonematóides, especialmente o nematóide de galhas M. incognita. Visando estudar os mecanismos envolvidos na resistência, foram construídas bibliotecas de ESTs de raiz de algodão resistente e susceptível a esse nematóide. As variedades de algodão resistente (IAC 96/414) e susceptível (IAC 98/708), cedidas pelo Institituto Agronômico de Campinas em São Paulo, foram desafiadas com o nematóide de galhas com o objetivo de identificar genes expressos diferencialmente nas plantas resistente e susceptível, durante a presença do nematóide. Cada planta foi inoculada com 1.200 J2s de M. incognita, depositados homogêneamente com a pipeta ao redor da base da raiz. As raízes das plantas de cada variedade foram coletadas após 2, 4 e 18 dias após a inoculação. Essas raízes foram acondicionadas imediatamente em nitrogênio líquido e mantidas em freezer a -80 C até o momento da extração dos RNAs. Para a construção das bibliotecas, foi determinada a reunião dos RNAs extraídos das plantas coletadas com 2, 4, 18 dias. Ambas as bibliotecas foram desenvolvidas com o kit "Superscript Plasmid System with Gateway Technology for cDNAs synthesis and Cloning". Os cDNAs foram então seqüênciados, e a montagem das seqüências das duas bibliotecas foi realizada em conjunto, de forma a se buscar genes que estivessem sendo diferencialmente expressos. Os dados gerados resultaram em 2.262 seqüências para as bibliotecas de raíz de algodão resistente e susceptível. A montagem resultou em 1.827 grupos, sendo 234 contigs e 1.593 singlets. No presente estudo, foram identificados vários genes que podem estar associados com defesa a nematóides, outros patógenos, além de proteínas envolvidas com resposta a estresse abiótico. Adicionalmente, o presente estudo teve como objetivo avaliar a função dos genes novos, 2E07, 7E12 e 17H02, expressos exclusivamente em glândulas esofagianas de M. incognita. Estes genes foram subclonados em vetores GATEWAY para expressão de RNAi e superexpressão de proteínas fusionadas a GFP. As construções foram utilizadas em transformação por Agrobacterium tumefasciens e as plantas transgênicas expressando as proteínas de secreção de M. incognita em fusão com GFP, foram analisadas quanto ao fenótipo externo e por microscopia das raízes infectadas. Para as construções contendo 2E07 e 7E12 (gf2E07 e gf7E12), ocorreu desenvolvimento maior das galhas e das células gigantes em relação às plantas-controle durante todo o experimento (8,16 e 28 dias pos-inoculos). Por fim, o número de nematóides eclodidos em 24 e 48 horas foi significativamente superior para a progênie das fêmeas que se alimentaram nas plantas transgênicas em relação aos controles. Este fato pode estar relacionado com um desenvolvimento prematuro das células gigantes nas plantas transgênicas infectadas com o nematóide. As plantas transgênicas para a expressão de dsRNAs (construções pk72E07, pk77E12 e pk717H02) mostraram alto grau de resistência ao nematóide de galhas (85-91%), enquanto as plantas controle foram bastante susceptíveis ao parasita de acordo com o teste de Tukey (p<0,001).

ASSUNTO(S)

rna interferente proteínas de secreção genômica funcional genes de resistência nematóides biologia molecular

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