Vias de sinalização de estresses em plantas : análise da região promotora do gene NIMIN-1 de Arabidopsis thaliana e da proteína ScCBL1 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) / Signal transductional pathways under biotic and abiotic stress in plants : functional analysis of NIMIN-1 promoter region in Arabidopsis and characterization of a calcium binding protein (ScCBL1) in sugar cane Saccharum spp.)

Jose Pedro Fonseca

Estresses bióticos e abióticos como a seca, salinidade e ataque por patógenos são responsáveis por perdas significantes em culturas de grãos ao redor do mundo. Diversos genes são regulados em resposta a esses fatores e podem ser ativados ou reprimidos para gerar uma resposta específica na planta de maneira a gerar uma resposta de defesa que atenue os efeitos do estresse e promoção de tolerância pela planta. É importante entendermos o funcionamento desses mecanismos moleculares, e dos genes e proteínas envolvidas nestas vias de sinalização para um melhor conhecimento de como estas vias de transdução operam em plantas, bem como no desenvolvimento de variedades de plantas tolerantes. No capítulo I deste trabalho nós descrevemos a análise funcional de um motivo de ligação do fator TGA localizado na região promotora do gene NIMIN-1 que é altamente induzido por ácido salicílico (SA) durante defesa de plantas (estresse biótico). Fatores TGA desempenham um papel chave na defesa de plantas através da interação com elementos presentes na região promotora de genes de defesa para induzir a sua expressão. O ácido salicílico (SA) é um fito-hormônio que induz a expressão do gene que codifica a proteína NIMIN-1. Essa proteína interage com a proteína NPR1/NIM1, reguladora da resistência sistêmica adquirida (SAR). Neste trabalho foi investigado se um motivo de ligação do fator TGA2 "TGACG", localizado na região promotora imediatamente anterior ao sítio de iniciação da transcrição de NIMIN-1, é necessário a indução de NIMIN-1 por ácido salicílico. Uma versão mutagenizada do promotor do gene NIMIN-1 foi gerada por mutação sítio-dirigida. Nós geramos construções T-DNA nas quais tanto a região promotora nativa quanto a mutagenizada foram fusionadas aos repórteres proteína verde fluorescente (GFP) e beta-glucuronidase (GUS). Foram geradas plantas transgênicas e a expressão de GFP sob o controle da região promotora de NIMIN-1 foi observada em raízes, no pecíolo e folhas de Arabidopsis. A atividade dirigida pelo promotor mutagenizado e o selvagem foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Tanto a construção contendo o promotor de NIMIN-1 como a cópia endógena de NIMIN-1 foram induzidas por SA. Em contraste, a construção promotora mutagenizada foi bem menos sensível a SA que o promotor nativo de NIMIN-1. Esse dado indica que o motivo de ligação do fator TGA2 analisado está diretamente envolvido na modulação da expressão de NIMIN-1 induzida por SA em Arabidopsis. No capítulo II nós descrevemos a caracterização da proteína ScCBL1 de cana-de-çúcar que apresenta elevada identidade com membros da família de proteínas sensoras de cálcio do tipo calcineurina B (CBL) em plantas. Experimentos de duplo-híbrido realizados em nosso grupo mostram que a proteína ScCBL1 interage com uma proteína quinase (ScCIPK8). Trabalhos prévios também desenvolvidos em nosso laboratório demonstraram que ScCIPK8 está envolvida no metabolismo do carboidrato e é diferencialmente expressa em resposta a ABA. O gene ScCBL1 foi clonado e a proteína codificada expressa e purificada a partir do extrato solúvel por cromatografia de afinidade usando resina Ni-NTA e a proteína eluída foi usada para estudos estruturais. Análises por espectrometria por dicroísmo circular (CD) mostraram que a proteína ScCBL1 é composta predominantemente por ?-hélices, em concordância com programas de predição da sequência de aminoácido desta proteína. Experimentos de espalhamento de raio-x a baixos ângulos (SAXS) indicaram que as amostras obtidas da ScCBL1 estavam homogêneas e monodispersas em solução e que ocorre uma mudança em seu estado oligomérico quando adicionado o agente redutor DTT, ocorrendo uma diminuição na intensidade de espalhamento (I(0)) a uma ordem de 1,56 para a mesma concentração, acompanhado de uma diminuição de 10 Å em seu raio de giro. As analises por SAXS indicaram que a proteína ScCBL1 é pentamérica em seu estado nativo e um trímero quando adicionado DTT. Análises por SAXS também indicaram que a proteína ScCBL1 está enovelada em solução, apresentando estrutura terciária estável. A modelagem de baixa resolução ab initio, juntamente com a função de distribuição das distâncias P(r) indicaram que a proteína possui um formato alongado (prolato). Ensaios iniciais de cristalização a partir de amostras monodispersas da proteína ScCBL1, confirmadas por DLS, foram feitas e um monocristal simétrico de aproximadamente 0.05 mm de diâmetro obtido além de outros sinais promissores para um refinamento das condições de cristalização de ScCBL1 para determinação de sua estrutura tridimensional a uma alta resolução. Esses dados contribuem para uma caracterização inicial da estrutura da proteína ScCBL1

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